Виролошке методе истраживања

Дијете

Виролошке методе истраживања се широко користе у медицини за дијагнозу различитих заразних и одређених онколошких болести вирусне природе.

Методе виролошког истраживања се такође користе за идентификацију вируса, проучавање њихове биологије и способност утицаја на животиње и људе, што даље помаже разумевању патогенезе вирусних болести и одабира правих метода за њихов третман. Поред успостављања етиологије болести и праћења ефикасности терапије, виролошке методе истраживања су од великог значаја у дефинисању и спровођењу антипидемичних мера.

Директне методе истраживања у вирологији

Директне виролошке методе истраживања могу открити вирус, вирусну нуклеинску киселину или вирусни антиген директно у клиничком материјалу и тиме су најбрже (експресне методе - до 24 х). Ови методи су мање информативни и захтевају лабораторијску потврду помоћу индиректних дијагностичких метода у вези са честим пријемом лажних негативних или лажних позитивних резултата. Следеће методе истраживања су директне:

  • електронска микроскопија са обојењем вируса методом негативног контрастирања (омогућава утврђивање присуства вируса и његове концентрације у материјалу, под условом да у 1 мл садржи најмање 105 вирусних честица);
  • Имунолошка електронска микроскопија, заснована на интеракцији специфичних антитела са вирусима да би се формирали комплекси који се лакше детектују са негативним контрастом од вируса;
  • ензим везан имуносорбент есеј (ЕЛИСА) коришћењем антитела ензима-обележеног који се везују за антигене да формирају комплексе, детектовано додавањем супстрата за ензим користи;
  • реакција имунофлуоресценције (РИФ) - директна или индиректна - заснована је на употреби антитела повезаних са флуоресцентном бојом;
  • радиоимуноассаи (РИА) заснива се на употреби антитела са ознаком радио и гама-бројача;
  • цитолошке методе заснивају се на микроскопском прегледу мрље, узорака биопсије, аутопсијских материјала;
  • молекуларне методе - молекуларна хибридизацију нуклеинских киселина и полимераза ланчана реакција (први се заснива на откривању комплементарних ланаца нуклеинске киселине са знаком, а друга - о секвенцама ДНК репликације вирус специфични основи у три фазе).

Постоје три варијанте молекуларне хибридизације нуклеинских киселина: тачка хибридизација, хибридизација блата (користи се за дијагнозу ХИВ инфекције) и ин ситу хибридизација (директно у зараженим ћелијама). ПЦР (полимеразна ланчана реакција) се сада све више користи у праћењу и дијагнози вирусних инфекција због високе осетљивости и специфичности ове методе.

Индиректне виролошке методе испитивања

Ове методе су засноване на идентификацији и идентификацији вируса. То су више времена и дуготрајне технике, међутим, прецизније. Материјал за такве студије могу бити садржај везикуле, струготини (малих богиња, херпетичних лезија коже и слузокожа), назофаринкса прање (респираторних инфекција), крви и ликвора (за арбовирус инфекције), фецес (за ентеровирус инфекције) испирања (витх ошпоре, рубеле, итд.). Због чињенице да вируси могу реплицира само у живим ћелијама, узгајање вирус се изводи у култури ткива, пилећег ембриона или у телу животиње (хрчци, бели мишеви, пси, мачке, неке врсте мајмуна). Индикација вируса које преносе цитопатског ефекта у гемадсорбтсии одговор на узорку боје, резултате инхибиције хемаглутинације, на промјенама или недостатак исте у пилећих ембриона или култура ткива, опстанак осетљивих животиња.

Серолошке дијагностичке методе које се користе у вирологији

Серолошка дијагноза значи виролошке истраживачке методе засноване на реакцији антиген-антитела. Најчешће се користе упарени серум крви, који се узимају у интервалима од неколико недеља. Када се титар антитела повећава 4 пута или више, реакција се сматра позитивном. Да би се одредио врста вируса, користи се реакција неутрализације вируса, како би се одредила специфичност групе, реакција фиксирања комплемента. Пасивна хемаглутинација, инхибиција хемаглутинације, обрнута пасивна хемаглутинација, РИФ и различите варијанте ензимског имуноассаиа такође се широко користе.

Недавно је у току студија генетичког инжењерства развијена техника за добивање моноклонских антитела. Уска специфичност моноклона превазилази се употребом неколико моноклонских антитела на различите вирусне детерминанте. Ово је повећало осетљивост и специфичност виролошких истраживачких метода са дефиницијом вирусних антигена. Тренутно су створени многи различити тестови за имунолошку дијагнозу вирусних инфекција.

Методе за проучавање вируса.

Историјски вирологија спун офф фром микробиологије, па чак микробиолошка техника није могла користити када се ради са вирусима, таквим општим принципима као што асептичним техникама, да добију чисте линије, методе титрације, и коначно, вакцинација, формирао је основу за нове науке. Даља студија о најважнијим особинама вируса захтијевала је развој неколико посебних метода. Тако, коришћен је способност вируса да прође кроз бактеријске филтере да се утврди њихову величину и чист, мала величина вируса стимулисала стварање више софистицираних техника микроскопије. Техничка арсенал оф Вирологи постепено обогатили методе физике, хемије, генетика, цитологија, молекуларне биологије и имунологије.

Вируси су мерени и мјерени, њихов хемијски састав, обрасци репродукције, мјесто у природи, улога у пореклу болести, те развити ефикасне методе за сузбијање вирусних инфекција. Вируси се узгајају посебним методама, инфицирањем лабораторијских животиња, пилећих ембриона и културе ткива. На зору вирологије су спроведене студије на лабораторијским животињама (беле мишеве, заморце, зечеве). Они су представили "сумњив материјал" и проценили су по обрасцу обољења који вирус је изазвао. За репродукцију и изолацију вируса, поред лабораторијских животиња, почели су се развијати и пчеларски ембриони у којима се неки вируси множе, акумулирају, понекад у значајним количинама.

Од раних 50-тих година КСКС века, развијена метода културе ткива ћелија живог ткива су одвојени ензимима, пребачен у посебан стерилну посуду, додајте сложеног састава хранљиве подлоге и ставити у инкубатору за раст. Ћелије почињу да се деле и постепено покривају површину стакла чак и сталним слојем. Ако су такве ћелије заражене вирусом, онда њихов деструктивни ефекат може бити директно посматран. Метод ткива култура омогућила за откривање нових вируса и служи за проучавање интеракције вируса и ћелија.

Изолација, умножавање и идентификација врста вируса су главне методе практичне виррологије. Овај рад обично се састоји од два главна дела: проучавање ћелија инфицираних вирусом и истраживање изолованих вируса.

Различити поступци за вирусологију дијагностике се користе за детекцију инфициране ћелије: метод флуоресцентног антитела, омогућава да јасно детектује присуство вируса у ћелијама које изгледају чист; метод рачуноводства за брзину и природе множења вируса основу уништења (тотално или делимично) ћелија. Важну улогу у дијагностици вирусне инфекције има одлучујућу специфичних титре антитела у серуму пацијената путем разних имунолошких реакција - неутрализације, фиксација комплемента, хемаглутинационе кашњење и друге.

ΙΙ. Карактеристике структуре и репродукције вируса

Дуго времена, постојање вируса оцењивано је њиховим патогеним ефектима. Директно се види да су вируси били могући тек након проналаска електронског микроскопа, дајући повећање десетине и стотина хиљада пута. То се догодило око 50 година након откривања вируса.

Највећи вируси приступају величини малих бактерија, најмањих - до великих протеинских молекула, на пример, молекулу хемоглобина крви. Другим речима, међу вирусима постоје гиганти и патуљци. За мерење вируса, користи се условна вредност, која се зове нанометар (нм). Један нанометар је милионити милиметра. Величине различитих вируса варирају од 20 до неколико стотина нм. За поређење, датићемо вредност најмањих крвних ћелија-еритроцита, једнака 7000-8000 нм, тј. вируси су мањи од црвених крвних зрнаца у десетинама и стотинама пута. По изгледу тела вируса подсећају на коцкице, штапове, кугле, полиедере и филаменте.

Једноставни вируси се састоје од протеина и нуклеинске киселине. Најважнији део честице вируса је нуклеинска киселина - она ​​је носилац генетских информација. Ако људске ћелије, животиње, биљке и бактерије увек садрже две врсте нуклеинских киселина - дезоксирибонуклеинске - ДНК и рибонуклеинских - РНК из различитих вируса откривен, само један тип - било ДНК или РНК, који формира основу њихове класификације. Друга обавезна компонента вириона је да се протеини разликују у различитим вирусима, што им омогућава да се препознају имунолошким реакцијама.

Сложенији вируси, поред протеина и нуклеинских киселина, садрже угљене хидрате, липиде. Свака група вируса има свој скуп протеина, масти, угљених хидрата и нуклеинских киселина. Неки вируси садрже ензиме.

Свака компонента вириона има посебне функције: протеин схелл штити од нежељених дејстава, нуклеинска киселина је одговорна за наследним и инфективних својстава и има водећу улогу у варијабилности вируса, а ензими укључени у њиховој репродукцији. Обично се нуклеинска киселина налази у средини вириона и окружена је протеинским премазом, као да је у њему одевена. Капсид се састоји од одређени начин сличних наслаганих протеинских молекула који чине симетричну геометријски облик, заједно са нуклеинском киселином вируса. У случају цубиц симетрије нуклеокапсидног ланцу нуклеинске киселине се ваљане у лопту и цапсомерс су тесно пакује око њега. Тако распоређени полио вирусе, слинавке и шапа, аденовирус, Реовируси, риновируси, и други. Уз спирале (род-схапед) симметрии вирус нуклеокапсидни ланац нуклеинске киселине уврнуто у спирали, сваки ред његових обухваћених цапсомерес блиско суседна један другом. Структура капсомера и изглед вириона могу се посматрати електронском микроскопијом.

Слика 3 - Дијаграм вируса хумане имунодефицијенције (1 - цапсомерс 2 - Гене 3 - Липопротеин коверта (суперкапсид); 4 - гликопротвиди)

Код сложених аранжираних вируса, језгро, у облику чврсто спојене спирале, покривено је једним или више спољних граната, које садрже различите супстанце. Таква структура има, на пример, велике богиње, вирусе грипе и параинфлуенце. Структура вирусних бактерија - бактериофага (фага), која се састоји од главе и репа, детаљно је проучена. Отров фага је обложен протеином, од којег одлазе дуга танка влакна, играјући улогу сисара када је фагна честица причвршћена за бактерију.

Датум подношења: 2016-06-22; виевс: 1281; НАЛАЖИТЕ ПИСМО РАДА

Методе истраживања вируса

ВИРУСОЛОШКА ИСТРАЖИВАЊА - студије спроведене ради дијагностиковања вирусних инфекција, проучавања релевантних патогена, њиховог ширења у природи, али иу производњи вирусних препарата. У виролошким лабораторијама (види) мед. профила су проучавани као људски вируси, тако да у неким случајевима могу бити и вируси животиња (нпр. дијагностика беснила код паса, преглед животиња који се користе за производњу вирусних препарата). Методе испитивања обојица су сличне.

Једна од главних фаза В. и. је изолација вируса. Уз изолацију вируса од људи користе крв, разне тајне и излучке, делови органа. Најчешће, крв се испитује код болести арбовируса. Користила је цело дефибринисану или хемолизирану крв, неке од његових елемената или ткива (у касним стадијумима болести). Вируси беснила, епидемија, паротитис, херпес симплекс могу се наћи у пљувачки. Насопхарингеал васхингс служе за изолацију патогена грипе, малих богиња, пситакозе, риновируса, респираторног синцицијског вируса, аденовируса. У флусовима из коњунктива се такође налазе аденовируси. Прање се узима испирањем нос и грла (засебно) и прање коњунктива изотоничним раствором натријум хлорида. Можете да обришете носне пролазе и задњи зид фаринге са тампонима навлаженим са броколом. Нестерилан материјал се третира антибиотиком (1000 јединица пеницилина и стрептомицина по мл) током 30 минута. Од фецеса се изолују различити ентеровируси, адено- и реовируси. Узорци се разблажу 1:10 фосфатним пуфером, центрифугирају два пута 20 минута. на 8000 обртаја у минуту. Антибиотици се додају као што је горе наведено. Мање често за В. и. узимајте садржај пустула (са великој дозами, пилићима, херпесом) и пунктирајућим органима (са венеричким лимфогрануломом). Секцијски материјал треба узимати што је пре могуће након смрти тела. Складиштено је до времена истраживања на т ° -20 ° и ниже. Извршити В. и. тканина је дробљена (млевена) и 10-20% муља припрема се на изотоничном раствору натријум хлорида или хранљивом средству за ћелијске културе. Центрифугира се 20 минута. на 1500 обртаја у минути; Супернатант се користи за даља испитивања.

За изолацију вируса, инфициране су лабораторијске животиње, ембриони птица, ћелије и ткива. Животиње су погодне ако вирус проузрокује да имају јасне клиничке симптоме болести или патоноатомске промене (нпр. Парализа, пнеумонија, итд.). Од тропизма вируса зависи ефикасност једног или другог начина увођења материјала. Широко користена инфекција под кожом, интраперитонеално и интравенозно. Неуротропску вируси детектовани инфекцијом животиња у церебралном хемисферу (арбовирусес, вирус беснила, итд), Тхаламус (полио вируса у експериментима на мајмуна), кичмена мождина. Вируси великих богиња и херпеса могу се открити примјеном материјала на зечеве на ожиљној рожњи. Неки вируси се лако могу детектовати инокулацијом у предњу комору очију (нпр. Вирус хепатитиса паса у експерименту за штене). За проучавање респираторних инфекција средства обично користи интраназално заражених животиња (инстилације у нос материјалну анестезирана животињи или га примену у облику аеросола у посебној комори). У дигестивном тракту, материјал се убризгава у храни или кроз уста с тупом игло. Приликом проучавања неких онкогених вируса користи се начин инфицирања златних хрчака у мукозу ушних ташних.

За многе вирусе, новорођенчад и сисари су више подложни сексуалним зрелим особама. Сисајући мишеви се широко користе за изолацију Арбовируса и Цоксацкие вируса (након инфекције у мозак). Неки аденовируси могу да индукују туморе са субкутаном инфекцијом новорођенчади златних хрчака. Студија о броју птичјих вируса врши се на пилићима првих дана живота.

Употреба пилећих ембриона има неколико предности. Њихова недиференцирана ткива имају широк опсег осетљивости на многе вирусе. Присуство инфекције се оцењује смрћу плода, појаве промене (питинг) на Цхорио-алантоисна мембране (сл. 1), акумулација течности у ембрионалног хемаглутинин и комплемент-везивање вирусног антигена. Ембриони инокулирани на цхориоаллантоиц мембрани (агед 11 - 12 дана пок вирус групе) у алантоинског и амнионске шупљине (10-11 дана миксовирусами), жуманца кесе (узраста 5-6 дана патогени пситтакозаорнитоза ет ал.). Вакцинација материјал ембриони у мозгу и интравенозно (шкољке судови) производе ретке. Са било којим методом инфекције, ембриони могу бити трауматизовани, тако да су они убијени у првих 24-48 сати. искључени из рачуноводства.

Да проучава утицај на вирусе хемограма. супстанце су веома погодне де-ембрионизоване јаје, у којима се ембрион уклања, али се чува хорионалеантоична мембрана. Унутра ставите вирус и супстанцу у 20 мл изотоничног раствора натријум хлорида. Отвор у љусци затворен је поклопцем цијеви, кроз коју можете узети узорке за анализу.

При процени експеримената на животињама и ембрионима птица треба имати у виду могућност изазивања латентних инфекција или изолације латентног вируса.

За изолацију и акумулацију вируса, ћелија и ткивних култура користе се екстензивно (види). Ове методе се могу користити за неговање најпознатијих вируса (види култивацију вируса). Неке од њих се интензивно акумулирају већ током примарне заразе усјева, док други захтевају неколико пролаза. Репродукција већине вируса у ћелијским културама праћена је развојем цитопатског ефекта. По својој природи у извесној мери може судити на вирусе који припадају одређеној раси: пицорнавируси изазивају заобљавање и ћелије скупљања, аденовирус - формирање кластера заобљених ћелија у облику грозду, миксовируси и херпес вирусима - формирање мулти-цоре синцитиа. Бројни вируси се не могу култивисати изван тела.

Репродукција неких вируса (вариола група миксо- и арбовирусес) могу се детектовати гемадсорбтсии реакцијом јер погођене ћелије стичу способност да адсорбује црвених крвних зрнаца. Одговарајуће еритроцити (човека, мајмуна, заморац, пилећи) при концентрацији од 0,4-0,5% је стављен на једног слоја на т ° 4 ° или на собној температури током 20 минута 30. Еритроцити су дифузно адсорбовани у целој култури (нпр. Вируси параинфлуенце) или оточни облици (вируси грипа, мумпс).

Множење вируса се понекад процењује испитивањем култивисане течности на животињама (енцефалитис који се преноси у крв) или у ДСЦ. Присуство вируса који нема цитопатску активност понекад је одређен његовом способношћу да омета цитопатогени вирус. Тако, у културама ћелија чирних ембриона инфицираних вирусима птичје леукемије, репродукција Раус саркома вируса је потиснута. То откривања вируса нетситопатогенних сојеве дијареје говеда и свиња колере предложене методе ЕНД (егзалтације вируса Невцастле болести) - суперинфекција култура Невцастле вирус болести. Са комбинованим деловањем оба вируса, долази до уништења ћелија.

Када се појаве цитопатске промене или други знаци мултипликације вируса, течност културе се користи за идентификацију вируса или пролаза. Неколико вируса остаје везано за ћелије чак иу случају дегенерације културе (аденовируси, вируси великих богиња), чиме се замрзавају и одмрзавају културе пре сакупљања течности. Неки херпетички вируси, на пример, вирус Марекове болести код пилића, морају бити трансплантирани заједно са нетакнутим ћелијама.

За проучавање људских респираторних коронских вируса и неких других, користи се метод ткивне културе, тј. Инфекција култивисаних фрагмената ткива ин витро. Најчешће коришћено ткиво је трахеја зеца. Вирус који се множи утиче на ендотелне ћелије слузокоже, која се одређује прекидом кретања цилија.

Требало би се узети у обзир могућност ванземаљских вируса у културама ткива и ћелија. Могу се уносити с ћелијама, ако се други узимају из зараженог организма, од трипсина или серума који се користи за култивацију ћелија.

Поред сетве или пресек биопсија материјалне нарасла културе наноси директно култивисање ћелије испитали орган после трипсинацијом често ефикаснији против вируса изолације (нпр., Детекција аденовируса у крајника). Користи се мешају културе поступка, када су теста тело ћелије расту заједно са неким вирусом осетљивим датим ћелијама (нпр., Сидирует ћелије у мозгу пацијената са субакутни склеротични паненцефалитис са ћелије бубрега мајмуна или Хела-ћелије за изолацију вируса малих богиња). Метод мешаних култура је често једини начин да изолују вирус од њих индуковане туморе код животиња које не производе активни вирус, међутим, садржи вирусни геном.

Једно-слојне ћелијске културе омогућавају добијање колонија вирусних плоча (Слика 2). Као правило, плакови формирају вирусе који имају цитопатску активност. У исто време, ова метода може да открије неке вирусе нетситопатогенние (нпр., Број сојева дијареје говеда). За добијање плака, вирус се примењује на монолаиер ћелије у шоље или равне боце. Мноштво инфекције, тј. Е. број виралних честица по ћелији треба да буду мале формирати плака није мерге. После 30-60 минута. слојевита адсорптион медијум са 1,35 - 1,5% агар, и неутрално црвено у финалној разблажењу од 1: 000. културе 40 Петријеве плоче су инкубиране у атмосфери са 5-10% угљен диоксида, и херметички затворене бочице - у конвенционалном пећници. После неколико дана, међу ћелијама које су ољтежене за живот, почињу да се појављују необојени жариште дегенерисаних ћелија.

На ћелијама можете ставити агар без неутралне црвене боје, а након неколико дана нанијети други слој агара са бојом; плакете постају видљиве након неколико сати. Агар понекад садржи сулфате полисахарида, који су инхибитори раста вируса; Да би их неутралисао, средишту је додан протамин сулфат (60 мг на 100 мл). За добијање плакета од неколико вируса, метилцелулоза и друге супстанце могу се користити као премази. Неки вируси (велике богиње, богиње) обликују плочице и без агарског премаза. Метода плака дозвољава клоналну анализу вирусних сојева. Да би се изоловали генетски хомогени клони, једна плоча је екстрахирана, која се користи за следећу инфекцију. Обично се клонирање врши за три пролаза.

Метода плака је такође погодна за одређивање у инфицираној култури број ћелија који производе вирус (тј. Број инфективних центара). За ово, ћелије су суспендоване, стављене на једнопластну културу индикаторских ћелија осетљивих на вирус и попуњене агаром. Око заражених ћелија формирају се плакови.

За дијагнозу вирусних инфекција и проучавање антигенске структуре вируса, користи се реакција талога у гелу. Најчешће, агар се користи за ову сврху. Антигени и специфична антитела смештена у агар гелу на одређеној удаљености дифузна и формирају преципитат у облику белих трака. 0,8-1% агар у изотоничном раствору натријум хлорида или пуферу у фосфату ставља се у капиларе или слојевито на слајдове. Антигени су пожељно пречишћени и концентровани. Састојци реакције наносе се на агар на супротне крајеве капиларног или на бунаре направљене у агарском слоју на стаклу на растојању од 5-6 мм. Инкубација траје 4-20 сати.

Значајан број В. и. врши се помоћу светлосне и електронске микроскопије. Највећи вируси (нпр. Велике богиње) након одговарајућег третмана (сребро, бојење Вицториа, итд.) Могу се открити уз конвенционалну микроскопију светлости. Овај метод се користи у дијагнози великих богиња испитивањем материјала из пустула. Карактеристично за неке инфекције је формирање телокних инцлусионс у ћелијама. Дакле, у језгри постоје инцлусионс фор херпетиц анд аденовирус инфецтион, у цитоплазми - са великим богињама (цорпусцле Гуарниери) и беснилом (Бабесх-Негри боди). Откривање инцлусионс је важно за дијагнозу беснила, великих богиња, цитомегалије, субакутног склерозинг паненцефалитиса и других.

Микроскопија у тамном пољу (погледајте Даркфиелд микроскопију) и фазно-контрастна микроскопија (видети) користе се у поглављу Чап. арр. да проучава динамику промена у вирусима инфицираних ћелија. Шире широка употреба луминесцентне микроскопије (види).

Истраживање размаза, отисака и једноплодних ћелијских култура које се узгајају на наочарима. Препарати (природни или фиксни) су често обојени акридином наранџе. Метода омогућава откривање великих вируса и кластера вирусних компоненти. Формације које садрже ДНК сјај са светлом зеленом светлошћу, а оне које садрже РНК су црвене боје. Још чешће када су В. и. производе третман заражених ћелија флуоресцентним антителима, што омогућава откривање кластера вирусног антигена. У директној методи користи се имунолошки гама глобулин означен флуоресцентном бојом, на пример, флуоресцеин-изотиоцианат. Са индиректном методом, препарат се третира са уобичајеним имуним серумом животиње, а затим са означеним антителима против гама глобулина ове животиње. Препарати се испитују у ултраљубичастом светлу, вирусни антиген се детектује светлоселом светлином (видети Имунофлуоресценцију). Метода брисака из назофаринкса омогућава рану дијагнозу респираторних вирусних инфекција - инфлуенца, параинфлуенза, рхино- и аденовирус, респираторни синцициј.

Електронска микроскопија (види) омогућава проучавање величине и структуре вирусних честица, као и суптилне промене које су им изазвале ћелије. Испитане су вирусне суспензије или ултра танке секције заражених ћелија. Неки вируси (нпр. Број људских и животињских онкорнавируса) могу се открити у ткиву само овим методом.

Б. и., Чија је сврха - да се утврди количина (титар) вируса или вирусних антитела, веома различита.

Под електронским микроскопом могуће је израчунати број честица вируса у суспензији ако је довољно пречишћена. Вирус се помеша са полистиренским латексом, број честица познатих. Смеша се прска на мрежу, број честица у појединачним падовима се рачуна. Однос броја честица латекса и вируса открива број вирионова у датом запремини. Ова метода не даје идеју о заразној активности вируса, с обзиром да вирусна муљ обично садржи значајан број неинфицијских честица.

Најтачнији начин утврђивања броја инфективних јединица у материјалу омогућава метод плоча. Једно-слојне ћелијске културе инфициране су малом дозом вируса. Титар се изражава бројем јединица за формирање плака (ПФУ) у 1 мл. Слично томе, може се одредити Титар вируса неку онкогени трансформацију кућа, као и она средства која формирају поцкмаркс на цхориоаллантоиц мембране пилећих ембриона (нпр., Вариола вирус).

Мање тачности је одређивање титра вируса методом терминалних дилуција. Конзистентно растуће разређивање (обично десетоструко) примењује се на осетљиву животињу, у пилеће ембрионе или ћелијске културе. С обзиром на резултат сваке ињекције као позитивне или негативне, одредити најмању дозу вируса, што може узроковати одређени ефекат (болест или смрт животиње, појављивање цитопатских промјена у култури итд.). Практично, ова доза је тешко одредити, па израчунајте доза која даје ефект од 50% (ЕД50). Одређује се у зависности од својстава вируса и методе титрације за број мртвих животиња (ЛД50), број случајева (ИД50), број ембриона који су развили вирусне хемаглутинине или антигене везујући комплемент, према броју ћелијских култура у којима су откривене цитопатске промене или хемасорптивна активност. Титар се изражава помоћу ЕД50 броја у одређеној количини материјала.

Од постојећих метода израчунавања ЕД50, најчешће се користи Реед-Мунцхов метод, заснован на принципу кумулације. Заснована је на претпоставци да сваки тестни предмет (миш, ембрион) који позитивно одговара на увођење ове разблажења одговара позитивном реакцијом на увођење више концентрисаног вируса. И, напротив, ако је ово разблаживање проузроковало негативну реакцију, онда ће увођењем већег разређивања бити негативна реакција. Интервали између разређивања са овом методом треба да буду исти, свако узгајање зарази не мање од 4 животиње (културе). Даљња интерполација између доза, што је изазвало ефекат најближих 50%. Обрачун се врши према формули:

где Б - најмања доза која је проузроковала ефекат више од 50%, б - Утицај дозе у процентима, и - највећи ефекат дозе проузрокована дејством мање од 50%, у процентима, д - интервал између логаритама два суседна дозе.

Вируси са израженом цитопатичком активношћу (нпр. Вирусом полио) могу се титрирати методом боје за тестирање. Заснива се на чињеници да се током раста ћелија снижава пХ медијума, ау инфицираним културама, у којима се ћелије дегенеришу, не постоји промјена у пХ медијума. Да би се откриле ове промене, на медијум је додан фенолни црвени индикатор, који има пХ више од 7 црвених, на пХ 7 наранџасту и на пХ испод 7, жутом. Фенол црвен се додаје у хранљиви медијум са пХ од 7,3-7,4 у коначној концентрацији од 1: 40,000. Одредити минималну дозу ћелија која мења боју медија од црвене до жуте (обично око 25,000 до 0,25 мл). Затим се припремају десетоструке разблажења вируса, од којих се сваки улије у 4-6 епрувета, на које се додаје ћелијска суспензија. Цеви су затворене гумираним затварачима или се улијева 0,6-0,8 мл вазелиног уља. Резултати се узимају у обзир након старења 5-7 дана на т ° 37 °. За титар вируса узимајте његово разблажење, спречавајући померање пХ на киселу страну у 50% цеви.

Способност имуног сера да неутрализује заразну активност вируса одређује се реакцијом неутрализације. Методе титрације серума су унапред одређене методама титрације одговарајућих вируса. Све су засноване на припреми смеша вируса са серумом, који се затим тестирају на присуство неутрализованог вируса. Реакција је стављена у две верзије. За један од њих се имунолошки и нормални серум у једном разблажењу (нпр. 1:10) помеша са повећањем 10-пута разблажења вируса у једнакој запремини и титар вируса се одређује у присуству оба сера. Коефицијент ЕД50 вирус у присуству нормалног серума на ЕД50 у присуству имуна ће бити индекс неутрализације овог разблаживања имуног серума. Овај резултат се не може интерполирати са другим разређивањем серума (нпр. Активност неразрејаног серума ће бити већа од израчунате). Алтернативно, константна доза вируса (обично око 100 ЕД50) комбинује се са серијом двоструких разблаживања тест серума. Серумски титер ће бити разређен, са вирусом који узрокује 50% ефекта.

У зависности од начина неутрализације вируса титрације реакција се изводи на лабораторијске животиње пилећих ембриона (њиховим хемагглутининс губитка или акумулације), у културама ћелија (за појаве цитопатског узорка мења боју и р. Н.). Уколико вирус представља поцкмаркс о цхориоаллантоиц мембрани пилећих ембриона, одредити највећи разблажења серума који смањује број поцкс на 50 или више процената. Слично томе, серуми се титрирају у складу са смањењем броја вирусних плакова на једноплодним ћелијским културама.

Вирус титрација РГЗ и ХАИ антитела се заснива на способности одређеног броја вируса (миксовируси, неки представници посквируса, аденовируси, пицорнавируси и Тогавиридае) црвених крвних зрнаца да се држимо заједно. Вирус се титрира у двоструким разблажењима са једнаким запремином од 0,5-1% суспензије еритроцита. Титар (АЕ 1 - аглутинације унит) заузме највиши разређење које проузроковао хемаглутинације (цм.). Хемагглутинатинг Титар вируса је мера његовог инфективног активност као хемаглутинационе) може изазвати незаразних "некомплетан" честице, инактивирани вирус и одвојити од одређене вирус Хемаглутинациони антигена. Сера у РТГА титрираним у двоструким разблажењима са вирусом 2-4 АЕ; титар се сматра највишим разређивањем, потпуно инхибира хемаглутинацију).

Неки вируси се адсорбују на еритроците, али не узрокују аглутинацију. Да бисте их открили, можете користити реакцију индиректне хемаглутинације. Заснован је на аглутинацији серум специфичног за вирус који је "оболел од еритхроците" у односу на овај вирус. Овај метод се углавном користи за серумску титрацију.

Реакција фиксирања комплемента (види) је погодна за титирање оба вируса (тачније, антигени везујући за комплементе) и антитела. У принципу, РСК са вирусима се не разликује од оног са бактеријским и другим антигеном. Разлике постоје само у начину припреме антигена. Вирусни антигени могу бити крв, испирање назофарингеала, урин, фецес пацијената, суспензије заражених органа, одвојени дијелови заражених пилићних ембриона и вирус који се узгаја у ћелијским културама. Најприкладнији су културни антигени. Суспензије заражених органа пре употребе више пута замрзавају и одмрзавају, у комбинацији са једнаком запремином етра или хлороформа, стресу 1-2 сата, а затим држе 18-20 сати. при т ° 4 °, поново замрзните, одмрзните и разјасните центрифугирањем. Да би се добила сера, животиње не би требало имунизирати вирусом који се култивише у истој супстрату као антиген за реакцију. У зависности од сврхе титрације, комбинују се двострука разређивања антигена са одређеном дозом серума или, обратно, двострука разређивања серума са једном дозом антигена. Контакт антигена, серума и комплемента се врши 1 сат т ° 37 ° или 18 х. при т ° 4-6 °. Након додавања хемо-система, материјал се инкубира 30 минута. при т ° 37 °. Резултати се процењују у складу са општим правилима.

Постоје методе за титрирање вируса и антитела на основу индикације вируса у ћелијама инфицираних култура флуоресцентним антителима, као и низ других који се ретко користе.

Токсични ефекат инхерентан одређеним вирусима се детектује давањем великих доза животињама на неуобичајен начин, при чему вирус не пролази кроз комплетан циклус репродукције. На примјер, вирус грипа се даје мишевима у мозгу или интравенозно. О његовом токсичном ефекту процењује се смрт животиња током првог дана.

Антигенска активност вируса (или вакцине) се утврђује имунизацијом људи или животиња, а затим одређује титар антитела у њиховом серуму. Имуногена активност вакцине, тј. Способност изазивања отпорности на инфекцију, одређује се имунизирањем животиња које су подложне вирусу. Затим, имунизиране животиње и контролни неимунизирани вируси су заражени са бројним разблажењима вируса, одређујући свој ЕД50 за обе групе. Разлика у добијеним индексима карактерише имуногеност тестираног лека. Ако вирус нема патогеност за животиње, имуногеност одговарајуће вакцине се може одредити само у епидемиолу. искуство.

Да проучи својства број вируса (величина, структура, хемијска. Завршава и м. П.) Мора бити пречишћени материјал са високим титра. Најчешће коришћени вирус се узгаја у ћелијским културама или у облику алантоичне течности инфицираних пилићких ембриона. Чишћење обично почињу диференцијалним центрифугирањем, прво на 15-20 хиљада г (г- убрзању гравитације) ослобађање материјала из ћелијске остатке, а на 50-100 хиљада г - таложи самог вируса... Да ослободи од великих честица се примењују филтрирањем кроз Азбестни заптивни (тип Сеитз), стакло и целулозу мембранским филтерима (Миллипоре типа). Фрагменти који су мањи од вируси могу да се уклони филтрирањем материјала кроз Сепхадек гелова, кашњење у зависности од величине пора одређене честица величине. За изоловање и концентрацију вируса из великих количина рабљених исољавање са амонијум и Натријум сулфати, алкохола падавина, алуминијум хидроксид или полиетилен гликол. Да би их ослободили од баластних протеина, такође се користи њихова варење са протеолитичким ензимима. Миксовируси се може пречистити и концентрише адсорпције еритроцита на ниској температури елуирање на вишим.

Даље пречишћавање и концентрација вируса произведени су овом или том методом фракционације. Ове методе се такође користе за одвајање мутантних вируса и појединачних вирусних компоненти. Када мешате вирус са системом фазом формира водене растворе два полимера, иде у једну од фаза у зависности од њихове величине, јонски састав медијума, пХ, итд за чишћење великих вирусе обично користе декстран система -. Метилцелулоза, мали - декстран сулфат са полиетилен гликолом. Полимери који остану након сепарације фазе често се уклањају током даљег пречишћавања вируса. Такође је могуће уклонити калијум хлорид додавањем декстран сулфата, метилцелулозу користећи амонијум сулфат, полиетилен гликол хлороформ и друге методе.

Вирус Пречишћавањем хроматографијом на колони на основу њихове способности да буде апсорбован на бројним супстанци, и елуирана од њих (види. Хроматографија) са променом пХ или соли концентрацију. Користи се за адсорпцију калцијум фосфата гелова, јоноизмењиваче на бази целулозе (обично ањонских измењивача, на пример, ДЕАЕ) јоноизмењивачке смоле. Елуирање вируса врши са калцијум фосфатом фосфатног пуфера решењима повећања концентрације и са јоноизмењивача бази целулозе - Натријум-хлорида.

Високо пречишћене суспензије се добијају центрифугирањем у течној колони са густином распоређеном у континуалном градијенту. Вирусне честице се сакупљају на нивоу где је густина медија једнака њиховој плодној густини. Зонално центрифугирање у градијенту сахарозе омогућава одвајање честица различитим масама. Материјал се примењује на градијент створен слојем одговарајућих сахарозних раствора. На крају центрифугирања се сакупљају фракције, пробијајући дно цеви. У равнотежи или изопикницу центрифугирање, честице вируса се суспендују у раствору цезијум хлорида, цезијум сулфата или рубидијум хлорида. Након продуженог центрифугирања створен је стабилни континуални градијент густине. На локацији вируса честице могу утврдити њихову густину. Треба напоменути да добивене вредности густине и масе честица вируса у извесној мери зависе од медијума који се користи у центрифугирању.

Када су В. и. Вируси означени различитим радиоактивним изотопима се широко користе. Најчешће коришћени угљеник 14 Ц, тритијум 3 Х, фосфор 32 П, сумпор 35 С, јод 131. Најлакше је означити вирус када је култивисан у ћелијским културама. Радиоактивност се одређује помоћу текућих сцинтилационих бројача или ауторадиографијом (види).

Цхем. састав вируса истражује конвенционални цхем. методе. Нуклеинска киселина обично се добија фенолном екстракцијом, а анионски детерџенти, додецил или натријум лаурил сулфат се користе мање често.

Да би се идентификовали вируси (види), прво је потребно установити њихову генеричку додатну опрему. За ово је потребно одредити величину и структуру вирусне честице формирају у себи нуклеинске те, присуство Липоид гранате. Тип нуклеинске киселине се најчешће одређује индиректним методама, на примјер, кориштењем способности бромодеоксиуридина да инхибира пролиферацију вируса које садрже ДНК. Присуство липоидног премаза у вирусу је утврђено његовом осетљивошћу на дејство етра и хлороформа (омотани вируси су инактивирани). Даље идентификација се врши са низом антисерума на познате вирусе помоћу различите реакције -. Неутрализовати, ДГЦ, ХИ, итд Мање имунизованих животиња производе познате вирус са даљим непознатим контаминације или обрнуто.

Библиографија: Лабораторијска дијагностика вирусних и рицкеттсиалних болести, ед. Е. Леннет и Н. Сцхмидт, пер. са енглеским., М., 1974, библиограф.; Луриа Г. Ие., Анд Даринл ЈЕ, Генерал вирологи, транс. са енглеским., М., 1970, библиограф.; Методе вирологије и молекуларне биологије, транс. са енглеским., М., 1972; ВА Схцхенников-Сх., Семенов БФ иЗезе-р о в Е. Г. / Стандардизатион оф метходс оф вирологицал ресеарцх, М., 1974, библиограф.; Приручник за лабораторијску дијагнозу вирусних и рицкеттсијалних болести, ед. ПФ Здродовски и МИ Соколов, М., 1965; Соколов МИ, Синитски АА и Ремезов ПИ Виролошке и серолошке студије код вирусних инфекција, Л., 1972; Вирологисцхе Пракис, хрсг, в. Г. Старке, Јена, 1968, Библиогр.

Методе истраживања вируса

Одличне карактеристике метода за проучавање вируса. Суштина, значај и примена електронске и имуноелектронске микроскопије, специфичност методе имунофлуоресценције. Опис методе молекуларне хибридизације. Шема електронског микроскопа.

Слање доброг дела базу знања је једноставно. Користите образац испод

Студенти, дипломци, млади научници који користе бази знања у својим студијама и раду бит ће вам захвални.

Хостед он хттп://ввв.аллбест.ру/

Министарство образовања и науке Руске Федерације

Образовна институција Савезног државног буџета вишег стручног образовања

Природно-математички факултет

Одељење за ботанику и генетику

Методе истраживања вируса

Завршено: Евтеева Д.С.

МЕТОДЕ ИСТРАЖИВАЊА ВИРУСА

ЕЛЕКТРОНСКА МИКРОСКОПИЈА ВИРУСА

МЕТОД МОЛЕКУЛАРНЕ ХИБРИДИЗАЦИЈЕ

ЛИСТА УПОТРЕБЕ ЛИТЕРАТУРЕ

Вируси као обавезни интрацелуларни паразити не могу се развијати на вештачким хранљивим медијима. Могу се репродуковати само у организмима осјетљивих домаћина или у живим ћелијама које су осјетљиве на вирус.

Организам рецептивног домаћина за проучавање вируса се користи у оним случајевима када нема експерименталних система за проучавање патогенезе вирусних инфекција, приликом испитивања сигурности вирусних вакцина или специфичне безазлености вирусних дроге. Поред очигледних предности, методе имају и недостатке и ограничења која се односе на потешкоће у стандардизацији и поновљивости резултата, али и због релативно високе цијене експеримената.

Ћелијске културе, уведене у истраживачку праксу 1940-их, радикално су промениле методолошки арсенал вирологије.

Тренутно, културне методе су фундаменталне у експерименталној и практичној вирусологији.

Методе истраживања које се користе у вирусологији значајно се разликују у сложености, што је првенствено због апсолутног интрацелуларног паразитизма вируса и њихове мале величине.

МЕТОДЕ ИСТРАЖИВАЊА ВИРУСА

Методе истраживања које се користе у вирусологији значајно се разликују у сложености, што је првенствено због апсолутног интрацелуларног паразитизма вируса и њихове мале величине.

У испитивању материјала добијених од пацијената са вирусним инфекцијама, различите методе се користе за лабораторијску дијагнозу ових болести:

· Методе електронске и имуноелектронске микроскопије;

· Метода молекуларне хибридизације;

· Метода имунофлуоресценције;

· Идентификација антитела класе лгМ.

ЕЛЕКТРОНСКА МИКРОСКОПИЈА

Електронска микроскопија је метода проучавања структура које су изван граница видљивости светлосног микроскопа и имају димензије мање од једног микрона (од 1 микрона до 1-5 А).
Деловање електронског микроскопа (Додатак 1, Слика 1) заснива се на употреби усмереног електронског зрака, који делује као светлосни сноп у светлосном микроскопу, а магнети (магнетна сочива) играју улогу сочива.

Због чињенице да различити дијелови предметног објекта задржавају електроне на различите начине, на екрану електронског микроскопа се добија црно-бела слика предметног објекта, увећана десетинама и стотинама хиљада пута. У биологији и медицини углавном се користе електронски микроскопи прозирног типа.

Електронска микроскопија је настала у 1930-им, када су добијене прве слике неких вируса (дуван мозаик вирус и бактериофаги). Тренутно је електронска микроскопија пронашла најшири примену у цитологији, микробиологији и вирусологији, што је довело до стварања нових грана науке. Са електронском микроскопијом биолошких предмета користе се специјалне методе припреме. Ово је неопходно за идентификацију појединачних компоненти проучаваних објеката (вируса), као и за очување њихове структуре под високим вакуумским условима под електронским зраком.

Уз помоћ електронске микроскопије истражује спољни облик предмета, истражује се молекуларна организација његове површине, користећи метод ултра танке секције, унутрашњу структуру објекта.

Електронска микроскопија у комбинацији са биохемијским, цитохемијских истраживачких метода, имунофлуоресценце и анализа рендгенске даје увид о саставу и функцијама конструктивних елемената ћелија и вируса.

Електронска микроскопија вируса обојених методом негативног контраста дозвољава диференцирање вируса и одређивање њихове концентрације. Употреба електронске микроскопије у дијагнози вирусних инфекција је ограничена на случајеве у којима је концентрација вирусних честица у клиничком материјалу довољно висока (105 у 1 мл или више).

Недостатак методе је немогућност разлике између вируса који припадају истој таксономској групи. Овај недостатак се елиминише коришћењем имунске електронске микроскопије.

Метода се заснива на формирању имунских комплекса када се специфичним серумима додаје вирусним честицама, док истовремена концентрација вирусних честица дозвољава да их идентификују. Метода се такође користи за откривање антитела. Ради експресивне дијагностике врши се електронско-микроскопско испитивање екстракта ткива, измета, течности из везикула, тајни из назофаринкса.

Електронска микроскопија се широко користи за проучавање морфогенезе вируса, његове могућности се продужавају коришћењем означених антитела.

ИММУНЕЕЛЕКТОНСКА МИКРОСКОПИЈА

То је директна визуализација интеракције антигена и антитела електронском микроскопијом, први пут је предложен за виролошке студије Ј. Алмеида и А. Ватерсон 1969. године.

Методично, ИЕМ тест се обавља у следећем низу:

1. Материјал у којем се сумња на жељени вирус се меша и инкубира са стандардним имуним серумом;

2. Комплекс вируса-антитела се преципитира центрифугирањем у одговарајућим режимима;

3. У ресуспендовани седимент се додаје контрастно средство, а добијени препарат се испитује под електронским микроскопом.

У случају позитивне реакције откривени су карактеристични агрегати који се састоје од вирусних честица повезаних мостовима антитела. Праг осетљивости ИЕМ је низак: поуздана детекција вируса је изводљива када је његова концентрација у почетном материјалу 10 ^ 4-10 6 честица / мл.

Предност ове методе је способност процјене не само исхода серолошке реакције, већ и идентификације његовог морфолошког супстрата, тј. Одређивања облика и величине вирусних честица. У присуству препарата вируса са познатим садржајем ИЕМ честица може да се користи за квантификацију антитела у серумима, које нуде посебан систем за снимање интензитет интеракције вируса и антитела.

Серолошки Метходс ин вирусологију основу класичне имунолошке реакције: Реакције су фиксација комплемента, инхибицију хемаглутинационе, биолошки неутрализацију, имунодифузија, индиректну хемаглутинационе, радијални хемолиза, имунофлуоресценције, ензим имуноесеја, радиоимуноиспитивања. Развијени су микрометоди многих реакција, њихова техника се континуирано побољшава.

Ове методе се користе за идентификацију вируса користећи познате скуп серума за серодијагностиковање и да утврди раст антитела у другом серуму у поређењу са првим (први серум узет после првих неколико дана болести, други -. После 2-3 недеље). Дијагностичка вредност није ништа мање од четири пута повећање антитела у другом серуму. Ако откривање ИгГ антитела указује на недавну инфекцију, онда ИгГ антитела трају већ неколико година, а понекад и за живот. Да би се идентификовали индивидуални антигени вируса и антитела са њима у комплексним смешама без претходног пречишћавања протеина, користите имуноблоттинг.

Метод комбинује сецира протеине полиакриламид гел електрофорезе затим иммуноиндикатсиеи протеине помоћу ЕЛИСА. Раздвајање протеина смањује захтеве за хемијску чистоћу антигена и омогућава идентификацију појединачних парова антиген-антитела. Овај проблем је важно, као што серодијагностиковање ХИВ, где лажно позитивне реакције имунотест због присуства антитела на ћелијских антигена, који су присутни као резултат недовољног чишћења вирусних протеина.

Идентификација антитела у серуму пацијената на унутрашње и спољашње вирусне антигене омогућава утврђивање стадијума болести, иу анализи популација - варијабилност вирусних протеина.

Имуноблотирање код ХИВ инфекције се користи као потврђивачки тест за детекцију појединачних вирусних антигена и антитела према њима. У анализи популација, метода се користи за одређивање варијабилности вирусних протеина.

Велика вредност методе лежи у могућности анализе антигена синтетизоване технологијом рекомбинантне ДНК, утврђивање њихове величине и присуства антигених детерминанти.

микроскоп за молекуларну хибридизацију вируса

Имунофлуоресцентна метода или реакција имунофлуоресценције (РИФ) се користи у микробиолошким лабораторијама опремљеним флуоресцентним микроскопом.

У студији се користе директне и индиректне реакције имунофлуоресценције.

Када се за дијагностику користи директна реакција имунофлуоресценције, на клизач се примењује клинички материјал утврђен етанолом.

Затим се дода луминесцентни серум. Спроведите испитивање лека под луминесцентним микроскопом.

Имунолошка реакција антиген-антитела се јавља директно на клизачу. На пример, антиген грипе који се придружио означеном имуноглобулину под микроскопом изгледа као јака сјајна честица лоцирана у језгру и цитоплазму заражених ћелија. Метода је једноставна, али захтева луминесцентне серуме за сваку врсту антигена.

Суштина индиректне реакције имунофлуоресценције је да се први на слајду антиген везује за специфичан (неозначен) серум. Луминесцентни серум се додаје у комплекс антигена-антитела формиран на стаклу.

Последњи корак је микроскопија која идентификује означене комплексе.

Овај метод троши малу количину луминесцентних сера, тако да се широко користи за откривање бактеријских, рицкеттсиалних, пнеумоцисте инфекција.

То олакшава идентификацију вируса грипа, параинфлуенза, аденовируса, респираторног синцицијског вируса, цитомегаловируса. Дијагноза легионеле и хламидијалне инфекције такође треба обавити реакцијом имунофлуоресценције да би се одредио одговарајући антиген.

МЕТОД МОЛЕКУЛАРНЕ ХИБРИДИЗАЦИЈЕ

Метода молекуларне хибридизације, заснована на откривању вирусних специфичних нуклеинских киселина, омогућава могућност детекције појединачних копија гена и несметано је степеном осетљивости.

Реакција је заснована на хибридизацији комплементарних ћелија ДНК или РНК (сонди) и формирању двоструких структура. Најјефтинија сонда је клонирана рекомбинантна ДНК. Сонда је означена радиоактивним прекурсорима (обично радиоактивни фосфор). Потенцијална употреба колориметријских реакција.

Постоји неколико варијанти молекуларне хибридизације: тачка, хибридизација блатине, хибридизација сендвича, ин ситу хибридизација итд.

ЛИСТА УПОТРЕБЕ ЛИТЕРАТУРЕ

1) лабораторијска дијагноза вирусних инфекција, Н.Н. Носик, В.М. Стакханова

2) Институт за вирусологију. Д. И. Ивановски РАМС, Москва ; Лабораторија Дијагноза оф Вирал Инфекције, Н.Н. Носик, В.М. Стацханова

3) Атлас анатомије и онтогенезе људских и животињских вируса, АА Авакиан, АФ Биковскии, 1970

4) Планета вируса, Царл Зиммер, 2012

5) хттп://ввв.сердецхно.ру/енциклопедииа/3171.хтмл